Purifikace proteinů: kapalinová chromatografie & gradientová eluce
s kolektorem frakcí OMNICOLL a LAMBDA peristatickými pumpami
Pro čištění proteinů a izolaci peptidů, nukleových kyselin nebo malých molekul ze směsi fermentačního media se používá kapalinová chromatografie (LC) s iontovou výměnou, hydrofobní interakcí, adsorpcí nebo s vyloučením podle velikosti molekul.
Za účelem optimalizace procesů kapalinové chromatografie se v laboratorní praxi úspěšně používají sběrače frakcí OMNICOLL a spolehlivá peristaltická čerpadla LAMBDA:
Příklad uspořádání s automatickým sběračem frakcí
Například kompletní uspořádání kolonové chromatografie s automatickým sběrem eluátu pomocí sběrače frakcí OMNICOLL zahrnuje:
- Dva obdobné zásobníky s elučním pufrem A a B spojené násoskou (nebo trubkou ve spodní části s ventilem pro nastavení průtoku)
- Eluční pufr A je trvale nasáván do kádinky s elučním pufrem B, který je neustále míchán magnetickým míchadlem, čímž se mění jeho koncentrace
- Programovatelná peristaltická pumpa LAMBDA pumpuje proměnlivou směs do kolony
- Eluát z kolony prochází detektorem (měření pH, absorbance při 280 nm, vodivosti)
- From the detector, the protein fractionation is collected by the OMNICOLL fraction collector into the desired containers (e.g.: tubes, vials, etc.)
- Z detektoru jsou frakce sbírány sběračem frakcí OMNICOLL do požadovaných nádob (např.: zkumavky, lahvičky atd.)
Proteiny se eluují změnou složení pufru (iontová síla, pH, vodivost, koncentrace solí atd.). Eluční podmínky lze měnit změnou toku pufru A do B, ve kterém se složení mobilní fáze v průběhu času mění.
Postup
Při kapalinové chromatografii je důležité mít kolonu naplněnou stacionární fází rovnoměrně bez vzduchových bublin, kanálů a trhlin.
Peristaltická pumpa LAMBDA čerpá kapalnou mobilní fázi kontinuálně do naplněné chromatografické kolony konzistentním reprodukovatelným průtokem bez pulzací.
Složky fermentačního média jsou adsorbovány a desorpovány v různém rozsahu na stacionární fázi, zatímco složky v mobilní fázi se od sebe pomalu oddělují.
Mobilní fáze protéká kolonou a odchozí eluát na spodním konci chromatografické kolony je sbírán pomocí sběrače frakcí OMNICOLL.
Detektor, který kontinuálně sleduje eluci proteinu z kolony nebo analýzu frakcí, poskytuje informace o koncentraci požadovaného proteinu ve frakci pro další zpracování, například: gelovou elektroforézou.
Optimalizace elučních metod při purifikaci proteinů
Výběr správného elučního pufru může značně zlepšit kvalitu separace a čas analýzy při purifikaci enzymů.
Izokratická eluce v kapalinové sloupcové chromatografii
V kapalinové chromatografii jsou proteiny odděleny za konstantního složení mobilní fáze (tj. izokratická eluce):
- Pokud vzorky nejsou příliš složité a také když vzorky nemají podobné retenční časy.
Kromě toho u nejpevněji adsorbovaných proteinů bude eluce s konstantním složením mobilní fáze trvat velmi dlouho.
Při izokratické eluci se používá pufr a peristaltická pumpa.
Gradientová eluce – pro purifikaci proteinů z komplexních směsí (biologické vzorky)
Při gradientové eluci se složení mobilní fáze mění během separace a ovlivňuje retenci analytů.
Gradientová eluce se používá při purifikaci proteinů:
- Složité biologické vzorky
- Směsi se známými vlastnostmi
- Komponenty s podobnými retenčními časy
Pokud se k purifikaci proteinů v kapalinové kolonové chromatografii používá gradientová eluce, může se retenční čas zkrátit.
Gradientová eluce se provádí se dvěma pufry a s jednou nebo dvěma peristaltickými pumpami.
Gradientová eluce a eluční profil
Při gradientové eluci se mění s časem složení mobilní fáze pro optimální separaci vzorku.
Retenční faktor a tím i kapacitní faktor mohou být ovlivněny odlišným složením eluentu (gradientová eluce).
Profily gradientu:
Nelineární gradienty nabízejí několik odlišných výhod, například kratší doba separace, lepší rozlišení vzorku anebo vyšší citlivosti detekce.
Biochemici doporučují peristaltické pumpy LAMBDA, která zaručují aplikaci mobilní fáze bez pulzací.
Generování gradientu spolehlivými peristaltickými pumpami
Laboratorní peristaltické pumpy LAMBDA jsou programovatelné a dálkově ovladatelné pro dosažení lineárního, krokového gradientu.
Gradientová eluce s jednou pumpou
Gradientovou eluci lze provádět také s jednou peristaltickou pumpou: nádoby s elučním pufrem A & B jsou spojeny sifonem nebo trubkou s ventilem pro nastavení průtoku.
- Eluční pufr A je permanentně natažen do kádinky s dobře promíchaným elučním pufrem B, kde se mění koncentrace pufru.
- Programovatelná peristaltická pumpa LAMBDA je použita k čerpání směsi do chromatografické kolony.
- Eluát z kolony dále prochází detektorem pro zjištění pH, absorbance při 280 nm a vodivosti.
- Z detektoru se frakce postupně jímají sběračem OMNICOLL do požadovaných nádob (např.: lahve, kádinky, zkumavky atd.).
Gradientová eluce s dvěma pumpami
Dvě programovatelné peristaltické pumpy LAMBDA jsou použity pro reprodukovatelné míchání eluentů pro gradientovou eluci.
- Změnu složení v průběhu času lze uskutečnit pomocí zadání programu přímo na displeji peristaltické pumpy LAMBDA nebo ji lze zaznamenat a zobrazit jako graf v reálném čase pomocí ovládacího programu PNet.
- Gradient směsi prochází přes chromatografickou kolonou a složky jsou separovány.
- Eluát z kolony dále prochází detektorem pro zjištění pH, absorbance při 280 nm a vodivosti.
- Automatický sběrač frakcí LAMBDA OMNICOLL, frakcionuje eluát a sbírá frakce na základě naprogramovaného času nebo počítače kapek.
Požadavky na čerpací systém pro sloupcovou chromatografii
Nejdůležitější požadavky na čerpací systém:
- Konstantní a reprodukovatelný průtok
Reprodukovatelnost závisí na retenčních časech píků. Retenční časy jsou závislé na průtoku.
- Průtok bez pulzací
Stacionární fáze musí být chráněna proti tlakovým nárazům. Základní linie detektoru by měla zůstat stabilní.
LAMBDA MULTIFLOW programovatelné peristaltické pumpy jsou vhodné k dosažení reprodukovatelných průtoků a mají 5letou záruční dobu.
Požadavky sběru při purifikaci proteinů
Nejdůležitější požadavky sběrače frakcí pro kapalinovou sloupcovou chromatografii jsou:
- Neomezená kapacita
Možnost sbírat neomezený počet frakcí je nesmírně důležitá, zejména při optimalizaci procesu.
Rozsah objemu
Možnost přizpůsobit sběrač frakcí pro různé laboratorní experimenty a procesy v pilotním fázi.
Přizpůsobitelný sběrač frakcí OMNICOLL je ideální pro efektivní optimalizaci procesů v laboratorním a pilotním měřítku.