Isolierung und Charakterisierung allelopathischer Verbindungen mittels Säulenchromatographie und Fraktionssammler LAMBDA OMNICOLL
Isolierung, Strukturaufklärung und chemische Synthese von allelopathischen Verbindungen Die Untersuchung von Pflanzen, Pilzen und anderen Mikroorganismen ist ein sehr arbeits- und zeitaufwändiges Unterfangen. Die Identifizierung hochwirksamer biologischer Strukturen ist jedoch von großer Bedeutung. (werden als natürliche Herbizide, Medikamente, Antioxidantien usw. verwendet) ist die dafür aufgewendete Zeit und Mühe wert.
Eine routinemäßige Untersuchung der allelopathischen Strukturanalyse gestaltet sich schwierig, wenn die Strukturen im Rohextrakt auch nach mehreren vorbereitenden Schritten zur Fraktionierung der Rohextrakte nicht identifiziert werden können. (durch Mazeration, ultraschall- oder mikrowellenunterstützte Extraktionen mit anschließender wässriger Zweiphasenextraktion usw.).
Der Forscher verfügt dann über ein großes Volumen an Lösungsmittel, das möglicherweise eine Teilmischung von Strukturen enthält. (mit oder ohne ähnliche biologische Aktivitäten). Biologische Aktivität Die Strukturen können anhand der biogeleitete Studien und Tests. Dieses große Volumen an Lösungsmittel sollte mithilfe von Lösungsmittelgemischen in kleinere Fraktionen aufgeteilt werden. unterschiedliche Polaritäten. Die Fraktionssammlung wird dazu beitragen, die aktivsten allelopathischen Moleküle für die gewünschte/angestrebte biologische Aktivität zu isolieren.
Meistens die Kieselgel-Flüssigkeitssäulenchromatographie wird zur Fraktionierung der Extrakte verwendet. Üblicherweise werden jedoch Eluate von etwa 65 - 200 Brüche, um das zu erreichen am stärksten gereinigte bioaktive Struktur in jedem Eluat. Die manuelle Sammlung einer großen Anzahl von Fraktionen ist aufgrund der hohen Kosten der auf dem Markt erhältlichen spektrophotometrischen Fraktionssammler die zeit- und arbeitsaufwändigste Phase im gesamten Forschungsprojekt.
Weitere Reinigungsschritte umfassen Dünnschichtchromatographie, bioaktive Assays, präparative Säulenchromatographie usw. und schließlich eine Liste von spektrometrische Analysen für die hochaktiven Strukturen, um deren chemische Synthese in Zukunft aufzuklären und zu erreichen.
Der Das Sammeln von 200 oder mehr Fraktionen lässt sich problemlos automatisieren. auf dem praktikabelsten Weg (wenn die richtige Bruchteilsammler wird ausgewählt!.
Isolierung und Reinigung allelopathischer Verbindungen mittels Säulenchromatographie an Kieselgel, zeitbasierter Fraktionierung mit dem Fraktionssammler OMNICOLL und Dünnschichtchromatographie (DC). Die gereinigten Verbindungen können durch UV-, IR-, LC-MS- und NMR-Spektroskopie charakterisiert werden.
Fraktionierung des Rohextrakts
Zunächst werden die Rohextrakte durch die Trennung in verschiedene diskrete Fraktionen aufgetrennt, die Verbindungen ähnlicher Polarität oder Molekülgröße enthalten. Säulenchromatographie. Bei dieser chromatographischen Trennung etwa Es wurden 65 Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 20 ml gesammelt. (zeitbasiert) durch die Bruchteilsammler OMNICOLL.
Dünnschichtchromatographie (DC)
Eine Aliquote aller gesammelten Fraktionen wurde auf aktivierte Kieselgel-Dünnschichtchromatographieplatten (20 x 20 cm) aufgetragen. Die Fraktionen wurden anhand der folgenden Kriterien vereinigt: Fleckenmuster und Rf-Werte auf der Dünnschichtchromatographieplatte. Die vereinigten Fraktionen wurden nummeriert (Fr.1 - Fr.8).
Präparative Dünnschichtchromatographie (DC) oder HPLC-Säulenchromatographie
Die Fraktionen (Fr.1 - Fr.8) können weiter gereinigt werden durch präparative Dünnschichtchromatographie und/oder HPLC-Säulenchromatographie. Die präparative HPLC hilft dabei, eine bestimmte Verbindung genauer zu isolieren.
Charakterisierung der allelopathischen Verbindungen
Die isolierten reinen Fraktionen werden dann zur Strukturbestimmung und auch zur erneuten Überprüfung der biologischen Aktivität verwendet.
Die Charakterisierung der reinen allelopathischen Verbindungen erfolgt mittels hochauflösender Mikroskopie. IR, MS, 1Hand 13C-NMR Spektren.
IR-Spektren werden verwendet, um die funktionellen Gruppen der isolierten Reinfraktion zu bestimmen. LC-MS liefert entweder ein empirisches oder ein exaktes (HRMS) Molekulargewicht, und NMR-Spektren geben Aufschluss über die Umgebung von Kohlenstoff und Wasserstoff. Die LC-MS-Analyse ermöglicht den Vergleich der Massenspektren.