Aislamiento y caracterización de compuestos alelopáticos mediante cromatografía en columna y colector de fracciones LAMBDA OMNICOLL
Aislamiento, elucidación estructural y síntesis química de compuestos alelopáticos. Los estudios sobre plantas, hongos y otros microorganismos son muy laboriosos y requieren mucho tiempo. Sin embargo, la identificación de estructuras biológicas altamente potentes (utilizados como herbicidas naturales, medicamentos, antioxidantes, etc.) Merece la pena el tiempo y el esfuerzo invertidos.
Un estudio rutinario sobre el análisis estructural de los aleloquímicos se vuelve difícil cuando las estructuras no se identifican en el extracto crudo, incluso después de varios pasos preliminares para lograr el fraccionamiento de los extractos crudos. (mediante maceración, extracciones asistidas por ultrasonidos o microondas seguidas de extracciones acuosas de dos fases, etc.).
El investigador se quedará entonces con un gran volumen de disolvente que puede contener una mezcla parcial de estructuras. (con o sin actividades biológicas similares). Actividad biológica de las estructuras se pueden identificar por la Estudio y ensayos bioguiados. Este gran volumen de disolvente debe dividirse en fracciones más pequeñas utilizando mezclas de disolventes con polaridades diferentes. La recolección de fracciones ayudará a aislar las moléculas alelopáticas más activas para la actividad biológica deseada/objetivo.
Principalmente, el cromatografía líquida en columna de gel de sílice se utiliza para el fraccionamiento de los extractos. Sin embargo, es común fraccionar y recolectar eluidos de aproximadamente 65 - 200 fracciones, para lograr el Estructura bioactiva más purificada en cada eluido. La recolección manual de un gran número de fracciones es la fase que más tiempo y esfuerzo consume en un proyecto de investigación general, debido al alto costo de los recolectores de fracciones espectrofotométricos disponibles en el mercado.
Los pasos de purificación adicionales incluyen: cromatografía de capa fina, ensayos bioactivos, cromatografía preparativa en columna etc. y finalmente, una lista de ensayos espectrométricos para las estructuras altamente activas, con el fin de dilucidar y lograr su síntesis química en el futuro.
El La recolección de 200 fracciones o más se puede automatizar fácilmente. de la manera más factible (si el adecuado colector de fracciones ¡Es elegido!.
Aislamiento y purificación de compuestos alelopáticos mediante cromatografía en columna de gel de sílice, fracciones obtenidas en función del tiempo con el colector de fracciones OMNICOLL y cromatografía en capa fina (TLC). Los compuestos purificados se caracterizan mediante estudios espectroscópicos UV, IR, LC-MS y RMN.
Fraccionamiento del extracto crudo
Inicialmente, los extractos crudos se separan en varias fracciones discretas que contienen compuestos de polaridades o tamaños moleculares similares mediante la cromatografía en columna. En esta separación cromatográfica, aproximadamente Se recolectaron 65 fracciones de 20 ml cada una. (basado en el tiempo) por el colector de fracciones ÓMNICOLL.
Cromatografía de capa fina (TLC)
Se cargó una alícuota de todas las fracciones recolectadas en placas de TLC de gel de sílice activado (20 x 20 cm). Las fracciones se agruparon en función de la patrón de manchas y valores Rf en la placa de TLC. Las fracciones combinadas se numeraron (Fr.1 - Fr.8).
Cromatografía en columna preparativa TLC o HPLC
Las fracciones (Fr.1 - Fr.8) pueden purificarse aún más mediante cromatografía en columna preparativa TLC y/o HPLC. La cromatografía líquida de alta resolución preparativa (HPLC preparativa) ayudará a aislar un compuesto en particular con mayor precisión.
Caracterización de los compuestos alelopáticos
Las fracciones puras aisladas se utilizan posteriormente para determinar la estructura y también para comprobar una vez más la actividad biológica.
La caracterización de los compuestos alelopáticos puros se realiza mediante espectroscopia de alta resolución. IR, MS, 1Mano 13RMN de 13C espectros.
Los espectros IR se utilizan para conocer los grupos funcionales de la fracción pura aislada. La cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) proporciona el peso molecular, ya sea empírico o exacto (HRMS), y los espectros de RMN revelan los entornos de carbono e hidrógeno. El análisis LC-MS ayuda a comparar el patrón de espectrometría de masas.