Izolace a charakterizace alelopatických sloučenin pomocí sloupcové chromatografie a frakčního sběrače LAMBDA OMNICOLL

Izolace, objasnění struktury a chemická syntéza alelopatických sloučenin z rostlin, hub a dalších mikroorganismů jsou velmi pracné a časově náročné studie. Identifikace vysoce účinných biologických struktur však (používají se jako přírodní herbicidy, léčiva, antioxidanty atd.) stojí za ten čas a úsilí vynaložené na to.

Rutinní studie alelochemické strukturní analýzy se stává obtížnou, pokud struktury nejsou v surovém extraktu identifikovány, a to ani po několika předběžných krocích k dosažení frakcionace surových extraktů. (macerací, extrakcí za pomoci ultrazvuku nebo mikrovln následovanou dvoufázovou vodnou extrakcí atd.).

Výzkumník pak zůstane s velkým objemem rozpouštědla, které může obsahovat částečnou směs struktur (s podobnými biologickými aktivitami nebo bez nich). Biologická aktivita struktur lze identifikovat podle bio-guided studie a testy. Tento velký objem rozpouštědla by měl být rozdělen na menší frakce pomocí směsí rozpouštědel s různé polarity. Sběr frakcí pomůže izolovat nejaktivnější alelopatické molekuly pro požadovanou/cílovou biologickou aktivitu.

Většinou chromatografie na kapalinové koloně silikagelu se používá k frakcionaci extraktů. Běžné je však frakcionovat a shromažďovat eluáty o objemu přibližně 65 - 200 frakcí, aby se dosáhlo nejčistší bioaktivní struktura v každém eluátu. Ruční sběr velkého počtu frakcí je časově a energeticky nejnáročnější fází v obecném výzkumném projektu, a to kvůli vysoké ceně spektrofotometrických sběračů frakcí na trhu.

Další kroky čištění zahrnují tenkovrstvá chromatografie, bioaktivní testy, preparativní sloupcová chromatografie atd. a nakonec seznam spektrometrické testy pro vysoce aktivní struktury, aby se v budoucnu objasnila a dosáhla jejich chemické syntézy.

Ten/Ta/To sběr 200 a více frakcí lze snadno automatizovat co nejproveditelnějším způsobem (pokud je správné sběrač frakcí je vybrán!).

Frakcionace surového extraktu

Nejprve se surové extrakty separují do různých samostatných frakcí obsahujících sloučeniny s podobnou polaritou nebo molekulární velikostí pomocí sloupcová chromatografie. V této chromatografické separaci asi Bylo odebráno 65 frakcí o objemu 20 ml (na základě času) podle sběrač frakcí OMNICOLL.

Tenkovrstvá chromatografie (TLC)

Alikvotní podíl všech shromážděných frakcí byl nanesen na aktivované silikagelové TLC destičky (20 x 20 cm). Frakce byly sloučeny na základě vzor skvrn a hodnoty Rf na TLC destičce. Spojené frakce byly očíslovány (Fr.1 - Fr.8).

Preparativní TLC nebo HPLC sloupcová chromatografie

Frakce (Fr.1 - Fr.8) lze dále čistit pomocí preparativní TLC a/nebo HPLC sloupcová chromatografie. Preparativní HPLC pomůže přesněji izolovat konkrétní sloučeninu.

Charakterizace alelopatických sloučenin

Izolované čisté frakce se poté použijí ke stanovení struktury a také k opětovnému ověření biologické aktivity.

Charakterizace čistých alelopatických sloučenin se provádí pomocí metody s vysokým rozlišením. IR, MS, ¹H a ¹³C NMR spektra.

IR spektra se používají ke zjištění funkčních skupin izolované čisté frakce. LC-MS udává buď empirickou, nebo přesnou (HRMS) molekulovou hmotnost a NMR spektra odhalují prostředí C a H. LC-MS analýza pomáhá porovnat MS obrazce.