Izolácia a charakterizácia alelopatických zlúčenín pomocou kolónovej chromatografie a frakčného zberača LAMBDA OMNICOLL
Izolácia, objasnenie štruktúry a chemická syntéza alelopatických zlúčenín z rastlín, húb a iných mikroorganizmov sú veľmi prácne a časovo náročné štúdie. Identifikácia vysoko účinných biologických štruktúr však (používané ako prírodné herbicídy, liečivá, antioxidanty atď.) stojí za ten čas a úsilie vynaložené na to.
Rutinná štúdia alelochemickej štrukturálnej analýzy sa stáva náročnou, keď štruktúry nie sú identifikované v surovom extrakte, a to ani po niekoľkých predbežných krokoch na dosiahnutie frakcionácie surových extraktov. (maceráciou, extrakciou pomocou ultrazvuku alebo mikrovlnného žiarenia, po ktorej nasledujú dvojfázové vodné extrakcie atď.).
Výskumník potom zostane s veľkým objemom rozpúšťadla, ktoré môže obsahovať čiastočnú zmes štruktúr (s podobnými biologickými aktivitami alebo bez nich). Biologická aktivita štruktúry možno identifikovať podľa bioriadená štúdia a testy. Tento veľký objem rozpúšťadla by sa mal rozdeliť na menšie frakcie pomocou zmesí rozpúšťadiel s rôzne polarity. Zber frakcií pomôže izolovať najaktívnejšie alelopatické molekuly pre požadovanú/cieľovú biologickú aktivitu.
Väčšinou, chromatografia na kvapalinovej kolóne silikagélu sa používa na frakcionáciu extraktov. Bežne sa však frakcionujú a zhromažďujú eluáty s hmotnosťou približne 65 – 200 frakcií, aby sa dosiahlo najčistejšia bioaktívna štruktúra v každom eluáte. Manuálny zber veľkého počtu frakcií je časovo a energeticky najnáročnejšou fázou vo všeobecnom výskumnom projekte kvôli vysokým nákladom na spektrofotometrické zberače frakcií na trhu.
Ďalšie kroky čistenia zahŕňajú tenkovrstvová chromatografia, bioaktívne testy, preparatívna kolónová chromatografia atď. a nakoniec zoznam spektrometrické testy pre vysoko aktívne štruktúry, aby sa v budúcnosti objasnila a dosiahla ich chemická syntéza.
Ten/Tá/To zber 200 alebo viacerých frakcií je možné ľahko automatizovať najrealistickejším spôsobom (ak je to správne zberač frakcií je vybraný!).
Izolácia a čistenie alelopatických zlúčenín pomocou stĺpcovej chromatografie na silikagéli, frakcií zhromaždených v čase pomocou zberača frakcií OMNICOLL a tenkovrstvovej chromatografie (TLC). Čistené zlúčeniny je možné charakterizovať UV, IR, LC-MS a NMR spektroskopickými štúdiami.
Frakcionácia surového extraktu
Surové extrakty sa najprv rozdelia na rôzne samostatné frakcie obsahujúce zlúčeniny s podobnou polaritou alebo molekulovou veľkosťou pomocou stĺpcová chromatografia. V tejto chromatografickej separácii približne Bolo zozbieraných 65 frakcií s objemom 20 ml (na základe času) podľa zberač frakcií OMNICOLL.
Tenkovrstvová chromatografia (TLC)
Alikvotná časť všetkých zozbieraných frakcií bola nanesená na aktivované silikagélové TLC platne (20 x 20 cm). Frakcie boli zlúčené na základe vzor škvŕn a hodnoty Rf na TLC platni. Spojené frakcie boli očíslované (Fr.1 - Fr.8).
Preparatívna TLC alebo HPLC stĺpcová chromatografia
Frakcie (Fr.1 - Fr.8) sa môžu ďalej čistiť pomocou preparatívna TLC a/alebo HPLC stĺpcová chromatografia. Preparatívna HPLC pomôže presnejšie izolovať konkrétnu zlúčeninu.
Charakterizácia alelopatických zlúčenín
Izolované čisté frakcie sa potom použijú na stanovenie štruktúry a tiež na opätovné overenie biologickej aktivity.
Charakterizácia čistých alelopatických zlúčenín sa vykonáva metódou s vysokým rozlíšením IR, MS, 1H a 13C NMR spektrá.
IR spektrá sa používajú na určenie funkčných skupín izolovanej čistej frakcie. LC-MS poskytuje buď empirickú, alebo presnú (HRMS) molekulovú hmotnosť a NMR spektrá odhaľujú prostredia C a H. LC-MS analýza pomáha porovnať MS obrazce.