Proteinreinigung: Flüssigkeitschromatographie & Gradientenelution

mit OMNICOLL Fraktionssammler und LAMBDA Peristaltikpumpen

Für Proteinreinigung Und Isolierung von Peptiden, Nukleinsäuren oder kleinen Molekülen aus der rohen Mischung der Fermentationsbrühe, flüssig Die Säulenchromatographie (LC) ist weit verbreitet. mit Ionenaustausch, hydrophober Wechselwirkung, Affinität oder Größenausschluss in der nachfolgenden Verarbeitung (DSP).

Um zu die Flüssigchromatographieprozesse optimieren, Der OMNICOLL-Fraktionssammler und die zuverlässigen LAMBDA-Peristaltikpumpen werden erfolgreich in der Laborpraxis eingesetzt:

Beispielhafte Einrichtung der automatischen Bruchteilerfassung

Zum Beispiel ein vollständiger Anordnung der Säulenchromatographie mit automatischer Sammlung Die Eluatmenge, die mit dem OMNICOLL-Fraktionssammler ermittelt wurde, umfasst:

LAMBDA OMNICOLL Fraktionssammler und LAMBDA Peristaltikpumpen zur Proteinreinigung mittels Konzentrationsgradientenelution

  • Zwei ähnliche Behälter mit Elutionspuffer A und B sind durch einen Siphon verbunden. (oder ein Rohr am Boden mit einem Ventil zur Durchflussregulierung)
  • Elutionspuffer A wird kontinuierlich in den Becher gezogen mit Elutionspuffer B was ständig mit einem Magnetrührer vermischt, damit Änderung der Pufferkonzentration
  • Programmierbare LAMBDA-Schlauchpumpe Pumpen Sie das Gradientengemisch in die Spalte
  • Eluat aus der Säule wird durch das Detektor (zur Messung von pH-Wert, Absorption bei 280 nm und Leitfähigkeit)
  • Vom Detektor, Proteinfraktionierung wird gesammelt von der OMNICOLL-Bruchteilsammler in die gewünschten Behälter (z. B. Röhrchen, Fläschchen usw.).

Die Proteine werden durch Änderung der Pufferzusammensetzung eluiert. (Ionenstärke, pH-Wert, Leitfähigkeit, Salzkonzentration usw.). Die Elutionsbedingungen können von linear, schrittweise oder segmentiert schrittweise geändert werden durch Änderung des Flusses von Puffer A nach B bei der sich die Zusammensetzung der mobilen Phase im Laufe der Zeit ändert.

Verfahren

Bei der Flüssigkeitssäulenchromatographie ist es wichtig, die Säule gleichmäßig zu packen. ohne Luftblasen, Kanäle und Risse in der stationären Phase.

Die LAMBDA-Schlauchpumpe versorgt die kontinuierlich flüssige mobile Phase zur gepackten Chromatographiesäule mit einer gleichbleibenden pulsationsfreier, reproduzierbarer Durchfluss.

Die auf die chromatographische Säule aufgetragene Probenmischung wird durch Durchlaufen der festen stationären Phase (Harz) getrennt:

Die Bestandteile der Fermentationsbrühe werden in unterschiedlichem Maße an der stationären Phase adsorbiert und desorbiert, die Komponenten in der mobilen Phase langsam separate voneinander.

Während die mobile Phase weiterhin durch die Säule fließt, werden das Säulenabflussprodukt oder Eluat … in Bruchteilen gesammelt am unteren Ende der chromatographischen Säule mit Hilfe des OMNICOLL-Fraktionssammlers .

Ein Detektor zur kontinuierlichen Überwachung der Proteinelution aus der Säule oder der Analyse der Fraktionen gibt Auskunft über die Konzentration des gewünschten Proteins in Fraktionen zur Weiterverarbeitung, zum Beispiel durch Gelelektrophorese.

Optimierung von Elutionsmethoden zur Proteinreinigung

Die Wahl des richtigen Elutionspuffers kann bei der Flüssigkeitschromatographie zur Enzymreinigung die Qualität der Trennung und die Analysezeit erheblich verbessern.

Isokratische Elution in der Flüssigkeitssäulenchromatographie

Bei der Flüssigkeitschromatographie werden die Proteine getrennt unter konstante Lösungsmittelzusammensetzung (d. h. isokratische Elution):

  • Wenn die Proben nicht sehr komplex sind und die Probenkomponenten keine ähnlichen Retentionszeiten aufweisen.

Darüber hinaus wird bei den am stärksten adsorbierten Proteinen die Elution mit konstanter mobiler Phasenzusammensetzung Die Elution dauert sehr lange..

Für die isokratische Elution werden Puffer und eine Peristaltikpumpe verwendet.

Gradientenelution – zur Reinigung von Proteinen aus komplexen Gemischen (biologischen Proben)

Bei der Gradientenelution ändert sich die Zusammensetzung der Änderungen der mobilen Phase während des Trennprozesses und beeinflusst die Retention der Analyten.

Die Gradientenelution wird vorteilhaft bei der Proteinreinigung eingesetzt:

  • Komplexe biologische Proben
  • MMischungen mit bekannten Eigenschaften
  • CKomponenten mit ähnlichen Retentionszeiten

Wird die Gradientenelution in der Flüssigkeitschromatographie zur Reinigung von Proteinen eingesetzt, dann Die Verweilzeit kann verkürzt werden.

Die Gradientenelution wird durchgeführt mit zwei Puffer Und eine oder zwei Schlauchpumpen.

Gradientenelution und Elutionsprofil

Gradientenelution bedeutet, dass die Zusammensetzung der mobilen Phase während der Probentrennung variiert wird, um eine optimale Trennung in minimaler Zeit zu erreichen.

Durch die unterschiedliche Zusammensetzung des Eluenten (Gradientenelution) können der Retentionsfaktor und somit der Kapazitätsfaktor beeinflusst werden.

Die Gradientenprofile:

 

Lineare Gradienten werden im Allgemeinen bevorzugt; dies kann implementiert werden in lineare, segmentierte, konvexe und konkave Formen. Die nichtlinearen Gradienten bieten mehrere deutliche Vorteile, darunter eine verkürzte Trennzeit, eine verbesserte Probenauflösung und eine höhere Nachweisempfindlichkeit.

Biochemiker empfehlen LAMBDA Peristaltik-Flüssigkeitspumpen die eine pulsationsfreie Applikation der mobilen Phase gewährleisten: www.lambda-instruments.com/peristaltic-pumps/.

Gradientenerzeugung mit zuverlässigen Peristaltikpumpen

Die peristaltischen Laborpumpen von LAMBDA sind programmierbar und fernsteuerbar, um Folgendes zu erreichen: lineare, schrittweise und segmentierte Gradientenelution.

Gradientenelution mit einer Pumpe

Die Gradientenelution kann auch mit einer einzigen Peristaltikpumpe durchgeführt werden: die Behälter mit Elutionspuffer A & B Sind durch einen Siphon verbunden oder ein Rohr am Boden mit einem Ventil zur Durchflussregulierung

  1. Elutionspuffer A wird kontinuierlich in das gut durchmischte Becherglas mit Elutionspuffer B überführt, wo Änderung der Pufferkonzentration

  2. Programmierbare LAMBDA-Schlauchpumpe verwendet für Pumpen Sie das Gradientengemisch in die Chromatographiesäule

  3. Das Eluat aus der Säule durchlief den Detektor zur Messung von pH-Wert, Absorption bei 280 nm und Leitfähigkeit.

  4. Vom Detektor, Eluatfraktionierung gesammelt mit dem OMNICOLL-Fraktionssammler in die gewünschten Behälter (z. B. Flaschen, Bechergläser, Röhren, Fläschchen usw.)

Gradientenelution mit zwei Pumpen

Zwei programmierbare LAMBDA-Schlauchpumpen werden zur reproduzierbaren Mischung der Eluenten für die Gradientenelution verwendet.

  1. Der Veränderung der Zusammensetzung im Laufe der Zeit kann sein programmiert direkt auf dem Display der LAMBDA-Peristaltikpumpe oder als Echtzeitdiagramm mit Hilfe der PNet-PC-Steuerungssoftware aufgezeichnet und angezeigt werden.

  2. Der Das Gradientengemisch durchläuft die Chromatographiesäule und die Komponenten werden getrennt.

  3. Das Eluat aus der Säule durchlief den Detektor, um die pH-Wert, Absorption bei 280 nm und Leitfähigkeit.

  4. Automatisierter Fraktionssammler LAMBDA OMNICOLL, fraktioniert das Eluat und sammelt die Bruchteile basierend auf der programmierten Zeit oder dem Fallzähler.

Anforderungen an das Pumpensystem für die Säulenchromatographie

Die wichtigsten Anforderungen an das Pumpensystem für die Säulenchromatographie sind:

  • Konstanter und reproduzierbarer Durchfluss
    Die Reproduzierbarkeit hängt von den Retentionszeiten der Peaks ab. Die Retentionszeiten sind von der Flussrate abhängig.

  • Pulsationsfreier Fluss
    Die stationäre Phase muss vor Druckstößen geschützt werden. Die Basislinie des Detektors muss stabil bleiben.

Für reproduzierbare Durchflussraten werden programmierbare Schlauchpumpen der Marke LAMBDA MULTIFLOW empfohlen, die mit einer 5-Jahres-Garantie ausgestattet sind.

Programmierbare Labor-Peristaltikpumpen von LAMBDA

Anforderungen an die Fraktion für die Proteinreinigung

Die wichtigsten Anforderungen an den Fraktionssammler für die Flüssigkeitssäulenchromatographie sind:

  • Uneingeschränkte Kapazität
    Die Möglichkeit, eine unbegrenzte Anzahl von Fraktionen zu sammeln, ist besonders bei der Prozessoptimierung von großer Bedeutung.

  • Unterschiedlicher Lautstärkebereich
    Um den Fraktionssammler für verschiedene Laborexperimente und Pilotprozesse anpassen zu können.

Der individuell anpassbare Fraktionssammler OMNICOLL eignet sich ideal für eine effiziente Prozessoptimierung im Labor- und Pilotmaßstab.