Purificação de proteínas: Cromatografia líquida e eluição em gradiente

com coletor de frações OMNICOLL e bombas peristálticas LAMBDA

Para purificação de proteínas e isolamento de peptídeos, ácidos nucleicos ou pequenas moléculas da mistura bruta do caldo de fermentação, líquido A cromatografia em coluna (LC) é amplamente utilizada. com troca iônica, interação hidrofóbica, afinidade ou exclusão por tamanho no processamento a jusante (DSP).

A fim de otimizar os processos de cromatografia líquida, O coletor de frações OMNICOLL e as confiáveis bombas peristálticas LAMBDA para líquidos são utilizados com sucesso na prática laboratorial:

Exemplo de configuração de coleta automática de frações

Por exemplo, um completo Configuração de cromatografia em coluna com coleta automática A análise do eluato utilizando o coletor de frações OMNICOLL inclui:

Coletor de frações LAMBDA OMNICOLL e bombas peristálticas LAMBDA para purificação de proteínas por eluição em gradiente de concentração.

  • Dois recipientes semelhantes com Os tampões de eluição A e B estão conectados por um sifão. (ou tubo na parte inferior com uma válvula para ajustar o fluxo)
  • Tampão de eluição A é consistentemente aspirado para dentro do béquer com tampão de eluição B que é constantemente misturado por agitador magnético, deste modo alterando sua concentração tampão
  • Bomba peristáltica LAMBDA programável para bombeie a mistura gradiente na coluna
  • Eluato da coluna está sendo passado através do detector (para medir pH, absorbância a 280 nm, condutividade)
  • A partir do detector, o fracionamento de proteínas é coletado pelo Coletor de frações OMNICOLL nos recipientes desejados (ex: tubos, frascos, etc.)

As proteínas são eluídas alterando-se a composição do tampão. (força iônica, pH, condutividade, concentração de sais, etc.). As condições de eluição podem ser alteradas de linear, gradual ou gradual segmentada por alterando o fluxo do tampão A para B em que a composição da fase móvel muda ao longo do tempo.

Procedimento

Na cromatografia em coluna líquida, é importante empacotar a coluna uniformemente. sem bolhas de ar, canais ou fissuras na fase estacionária.

A bomba peristáltica LAMBDA fornece o fase móvel líquida continuamente para a coluna cromatográfica empacotada de forma consistente vazão reproduzível sem pulsação.

A mistura da amostra carregada no topo da coluna cromatográfica é separada pela passagem através da fase estacionária sólida (resina):

Os componentes do caldo de fermentação são adsorvidos e dessorvidos em diferentes graus na fase estacionária, enquanto os componentes na fase móvel lentamente separar um do outro.

À medida que a fase móvel continua a fluir pela coluna, o efluente da coluna, ou eluato, são coletados em frações na extremidade inferior da coluna cromatográfica com a ajuda do coletor de frações OMNICOLL .

Um detector para monitorar continuamente a eluição de proteínas da coluna ou do análise das frações fornece informações sobre o concentração da proteína desejada em fração para processamento posterior, por exemplo: por eletroforese em gel.

 

Otimização de métodos de eluição para purificação de proteínas

A escolha do tampão de eluição correto, em cromatografia líquida para purificação de enzimas, pode melhorar consideravelmente a qualidade da separação e o tempo de análise.

Eluição isocrática em cromatografia em coluna líquida

Na cromatografia líquida, as proteínas são separadas sob composição de solvente constante (ou seja, eluição isocrática):

  • Quando as amostras não são muito complexas e também quando os componentes da amostra não têm tempos de retenção semelhantes.

Além disso, para as proteínas mais fortemente adsorvidas, a eluição com composição constante da fase móvel irá demoram muito tempo para serem eluídos.

Utilizam-se tampão e bomba peristáltica para eluição isocrática.

Eluição em gradiente - para purificação de proteínas a partir de misturas complexas (amostras biológicas)

Na eluição em gradiente, a composição do mudanças de fase móvel durante o processo de separação e influencia a retenção dos analitos.

A eluição em gradiente é vantajosamente utilizada na purificação de proteínas:

  • amostras biológicas complexas
  • Mmisturas com propriedades conhecidas
  • Ccomponentes com tempos de retenção semelhantes

Se a eluição em gradiente for usada na cromatografia líquida em coluna para a purificação de proteínas, então O tempo de retenção pode ser reduzido.

A eluição em gradiente é realizada com dois buffers e uma ou duas bombas peristálticas.

Eluição em gradiente e perfil de eluição

A eluição em gradiente implica que a composição da fase móvel será variada durante a separação da amostra para uma separação ideal no menor tempo possível.

Com a composição variável do eluente (eluição em gradiente), o fator de retenção e, consequentemente, o fator de capacidade podem ser influenciados.

Os perfis de gradiente:

 

Geralmente, prefere-se o uso de gradientes lineares; isso pode ser implementado em formas lineares, segmentadas, convexas e côncavas. Os gradientes não lineares oferecem diversas vantagens distintas, incluindo tempo de separação reduzido, melhor resolução da amostra e maior sensibilidade de detecção.

Bioquímicos recomendam bombas peristálticas LAMBDA para líquidos que garantem a aplicação da fase móvel sem pulsações: www.lambda-instruments.com/bombas-peristalticas/.

Geração de gradientes com bombas peristálticas confiáveis

As bombas peristálticas de laboratório LAMBDA são programáveis e controláveis remotamente para atingir os objetivos desejados. eluição por gradiente linear, gradual e segmentado.

Eluição em gradiente com uma única bomba

A eluição em gradiente também pode ser realizada com uma única bomba peristáltica: os recipientes com tampão de eluição A e B são conectados por um sifão ou tubo na parte inferior com uma válvula para ajustar o fluxo

  1. O tampão de eluição A é aspirado de forma consistente para o béquer com agitação constante contendo o tampão de eluição B, onde o A concentração do tampão está sendo alterada.

  2. Bomba peristáltica LAMBDA programável usada para bombeie a mistura gradiente na coluna de cromatografia

  3. O eluato da coluna passou pelo detector para medir o pH, a absorbância a 280 nm e a condutividade.

  4. A partir do detector, o fracionamento do eluato coletado pelo coletor de frações OMNICOLL nos recipientes desejados (Exemplos: garrafas, béqueres, tubos, ampolas, etc.)

Eluição em gradiente com duas bombas

Duas bombas peristálticas LAMBDA programáveis São utilizadas para a mistura reprodutível dos eluentes na eluição em gradiente.

  1. O mudança na composição ao longo do tempo pode ser programado diretamente no visor da bomba peristáltica LAMBDA ou pode ser gravado e exibido como um gráfico em tempo real usando o software de controle PNet para PC.

  2. O A mistura em gradiente passa pela coluna de cromatografia. e os componentes são separados.

  3. O eluato da coluna passou pelo detector para medir o pH, absorção a 280 nm e condutância.

  4. Coletor automático de frações LAMBDA OMNICOLL, fraciona o eluato e recolhe as frações com base no tempo programado ou no contador de gotas.

 

Requisitos do sistema de bombeamento para cromatografia em coluna

Os requisitos mais importantes do sistema de bombeamento para cromatografia em coluna são:

  • Vazão constante e reproduzível
    A reprodutibilidade depende dos tempos de retenção dos picos. Os tempos de retenção dependem da vazão.

  • Fluxo sem pulsação
    A fase estacionária deve ser protegida contra picos de pressão. A linha de base do detector deve permanecer estável.

 

As bombas peristálticas programáveis LAMBDA MULTIFLOW, que vêm com 5 anos de garantia, são recomendadas para obter taxas de fluxo reproduzíveis.

Bombas peristálticas programáveis LAMBDA para laboratório

Requisitos da fração para purificação de proteínas

Os requisitos mais importantes do coletor de frações para cromatografia em coluna líquida são:

  • Capacidade irrestrita
    A possibilidade de coletar um número ilimitado de frações é extremamente importante, especialmente durante a otimização do processo.

  • Faixa de volume diferente
    Para possibilitar a adaptação do coletor de frações a diversos experimentos de laboratório e processos em escala piloto.

 

O coletor de frações personalizável OMNICOLL é ideal para a otimização eficiente de processos em escala laboratorial e piloto.