Purificación de proteínas: Cromatografía líquida y elución por gradiente.

con colector de fracciones OMNICOLL y bombas peristálticas LAMBDA

Para purificación de proteínas y aislamiento de péptidos, ácidos nucleicos o moléculas pequeñas a partir de la mezcla cruda de caldo de fermentación, líquido La cromatografía en columna (LC) se utiliza ampliamente. con intercambio iónico, interacción hidrofóbica, afinidad o exclusión por tamaño en el procesamiento posterior (DSP).

Con el fin de optimizar los procesos de cromatografía líquida, El colector de fracciones OMNICOLL y las fiables bombas peristálticas de líquido LAMBDA se utilizan con éxito en la práctica de laboratorio:

Ejemplo de configuración de recolección automática de fracciones

Por ejemplo, un completo Disposición de cromatografía en columna con recolección automática El eluato obtenido mediante el colector de fracciones OMNICOLL incluye:

Colector de fracciones LAMBDA OMNICOLL y bombas peristálticas LAMBDA para la purificación de proteínas mediante elución por gradiente de concentración.

  • Dos contenedores similares con Los tampones de elución A y B están conectados por un sifón. (o un tubo en la parte inferior con una válvula para regular el flujo)
  • Tampón de elución A es constantemente atraído hacia el vaso de precipitados con tampón de elución B que es constantemente mezclado mediante agitador magnético, por lo tanto alterando su concentración de tampón
  • Bomba peristáltica LAMBDA programable para bombea la mezcla de gradiente en la columna
  • Eluir de la columna está siendo pasado a través del detector (para medir el pH, absorbancia a 280 nm, conductancia)
  • Desde el detector, el fraccionamiento de proteínas es recolectado por el colector de fracciones OMNICOLL en los recipientes deseados (por ejemplo: tubos, viales, etc.)

Las proteínas se eluyen cambiando la composición del tampón. (fuerza iónica, pH, conductividad, concentración de sales, etc.). Las condiciones de elución se pueden cambiar de lineales, escalonadas o segmentadas por pasos mediante cambiando el flujo del búfer A al B en la que la composición de la fase móvil cambia con el tiempo.

Procedimiento

En la cromatografía líquida en columna, es importante rellenar la columna de manera uniforme. sin burbujas de aire, canales ni grietas en la fase estacionaria.

La bomba peristáltica LAMBDA suministra el fase móvil líquida de forma continua a la columna de cromatografía empaquetada a una velocidad constante. caudal reproducible sin pulsaciones.

La mezcla de muestra cargada en la parte superior de la columna cromatográfica se separa al pasar a través de la fase estacionaria sólida (resina):

Los componentes del caldo de fermentación se adsorben y desorben en diferente medida en la fase estacionaria, mientras que los componentes en la fase móvil lentamente separado uno del otro.

A medida que la fase móvil continúa fluyendo a través de la columna, el efluente o eluido de la columna, son recolectados en fracciones en el extremo inferior de la columna cromatográfica con la ayuda del colector de fracciones OMNICOLL .

Un detector para monitorear continuamente la elución de proteínas de la columna o la análisis de las fracciones proporciona información sobre el concentración de la proteína deseada en fracción para su posterior procesamiento, por ejemplo: mediante electroforesis en gel.

 

Optimización de los métodos de elución para la purificación de proteínas.

En la cromatografía líquida para la purificación de enzimas, elegir el tampón de elución adecuado puede mejorar considerablemente la calidad de la separación y el tiempo de análisis.

Elución isocrática en cromatografía líquida en columna

En la cromatografía líquida, las proteínas se separan bajo composición constante del disolvente (es decir, elución isocrática):

  • Cuando las muestras no son muy complejas y, además, cuando los componentes de la muestra no tienen tiempos de retención similares.

Además, para las proteínas más fuertemente adsorbidas, la elución con una composición constante de la fase móvil será tardan mucho tiempo en ser eluidas.

Para la elución isocrática se utilizan un tampón y una bomba peristáltica.

Elución por gradiente: para la purificación de proteínas a partir de mezclas complejas (muestras biológicas).

En la elución por gradiente, la composición de la Cambios de fase móvil durante el proceso de separación e influye en la retención de los analitos.

La elución por gradiente se utiliza ventajosamente en la purificación de proteínas:

  • Muestras biológicas complejas
  • Mmezclas con propiedades conocidas
  • Ccomponentes con tiempos de retención similares

Si se utiliza la elución por gradiente en la cromatografía líquida en columna para la purificación de proteínas, entonces El tiempo de retención puede acortarse.

La elución por gradiente se lleva a cabo con dos amortiguadores y una o dos bombas peristálticas.

Elución por gradiente y perfil de elución

La elución por gradiente implica que la composición de la fase móvil variará durante la separación de la muestra para lograr una separación óptima en el menor tiempo posible.

Con la diferente composición del eluyente (elución por gradiente), el factor de retención y, por lo tanto, el factor de capacidad podrían verse influenciados.

Los perfiles de gradiente:

 

Generalmente se prefieren los gradientes lineales; se puede implementar en formas lineales, segmentadas, convexas y cóncavas. Los gradientes no lineales ofrecen varias ventajas distintivas, entre ellas un menor tiempo de separación, una mejor resolución de la muestra y una mayor sensibilidad de detección.

Los bioquímicos recomiendan Bombas peristálticas de líquido LAMBDA que garantizan una aplicación sin pulsaciones de la fase móvil: www.lambda-instruments.com/peristáltic-pumps/.

Generación de gradientes con bombas peristálticas fiables.

Las bombas peristálticas de laboratorio LAMBDA son programables y controlables a distancia para lograr elución con gradiente lineal, escalonado y segmentado.

Elución por gradiente con una sola bomba

La elución por gradiente también se puede realizar con una bomba peristáltica: los contenedores con tampón de elución A y B son conectados por un sifón o un tubo en la parte inferior con una válvula para ajustar el flujo.

  1. El tampón de elución A se introduce de forma continua en el vaso de precipitados bien agitado con el tampón de elución B, donde Se está alterando la concentración del tampón

  2. Bomba peristáltica LAMBDA programable utilizada para bombea la mezcla de gradiente en la columna de cromatografía

  3. El eluido de la columna pasó a través del detector para medir el pH, la absorbancia a 280 nm y la conductancia.

  4. Desde el detector, el Fraccionamiento del eluato recolectado mediante el colector de fracciones OMNICOLL en los contenedores deseados (p. ej.: botellas, vasos de precipitados, tubos, viales, etc.)

Elución por gradiente con dos bombas

Dos bombas peristálticas LAMBDA programables Se utilizan para la mezcla reproducible de los eluyentes en la elución por gradiente.

  1. El cambio en la composición a lo largo del tiempo puede ser programado La información puede visualizarse directamente en la pantalla de la bomba peristáltica LAMBDA o bien, registrarse y mostrarse como un gráfico en tiempo real mediante el software de control PNet para PC.

  2. El La mezcla de gradiente pasa a través de la columna de cromatografía. y los componentes se separan.

  3. El eluido de la columna pasó a través del detector para medir la pH, absorbancia a 280 nm y conductancia.

  4. Colector de fracciones automatizado LAMBDA OMNICOLL, fracciona el eluato y recoge las fracciones en función del tiempo programado o del contador de gotas.

 

Requisitos del sistema de bombeo para cromatografía de columna

Los requisitos más importantes del sistema de bombeo para cromatografía en columna son:

  • Caudal constante y reproducible
    La reproducibilidad depende de los tiempos de retención de los picos. Los tiempos de retención dependen del caudal.

  • Flujo sin pulsaciones
    La fase estacionaria debe protegerse contra sobrepresiones. La línea base del detector debe permanecer estable.

 

Se recomienda el uso de bombas peristálticas programables LAMBDA MULTIFLOW, que cuentan con una garantía de 5 años, para lograr caudales reproducibles.

Bombas peristálticas de laboratorio programables LAMBDA

Requisitos de la fracción para la purificación de proteínas

Los requisitos más importantes del colector de fracciones para cromatografía líquida en columna son:

  • Capacidad ilimitada
    La posibilidad de recolectar un número ilimitado de fracciones es extremadamente importante, especialmente durante la optimización del proceso.

  • Rango de volumen diferente
    Para poder adaptar el colector de fracciones a diversos experimentos de laboratorio y procesos a escala piloto.

 

El colector de fracciones personalizable OMNICOLL es ideal para la optimización eficiente de procesos a escala de laboratorio y planta piloto.