Protein saflaştırma: Sıvı kromatografisi ve kademeli elüsyon

OMNICOLL fraksiyon toplayıcı ve LAMBDA peristaltik pompaları ile

İçin protein saflaştırma Ve peptitlerin, nükleik asitlerin veya küçük moleküllerin izolasyonu Fermantasyon sıvısının ham karışımından, sıvı Kolon kromatografisi (LC) yaygın olarak kullanılmaktadır. İyon değişimi, hidrofobik etkileşim, afinite veya boyut dışlama yoluyla aşağı akış işleminde (DSP) kullanılır.

İçin sıvı kromatografi süreçlerini optimize etmek, OMNICOLL fraksiyon toplayıcı ve güvenilir LAMBDA peristaltik sıvı pompaları laboratuvar uygulamalarında başarıyla kullanılmaktadır:

Otomatik kesir toplama örneği kurulumu

Örneğin, tam bir otomatik toplama özelliğine sahip kolon kromatografisi düzenlemesi OMNICOLL fraksiyon toplayıcı kullanılarak elde edilen elüatın içeriği şunları içerir:

LAMBDA OMNICOLL fraksiyon toplayıcı ve LAMBDA peristaltik pompalar, konsantrasyon gradyanlı elüsyon yöntemiyle protein saflaştırma için kullanılmaktadır.

  • İki benzer kap Sifonla birbirine bağlı elüsyon tamponu A ve B (veya altta akışı ayarlamak için vanalı bir boru)
  • Elüsyon tamponu A Beherin içine sürekli olarak çekilir. elüsyon tamponu B sürekli manyetik karıştırıcı ile karıştırıldı, böylece tampon konsantrasyonunu değiştirerek
  • Programlanabilir LAMBDA peristaltik pompa Eğimli karışımı pompalamak sütuna
  • Kolondan süzülen sıvı içinden geçiriliyor dedektör (pH ölçümü, 280 nm absorbans, iletkenlik)
  • Dedektörden, protein fraksiyonlaması tarafından toplanır OMNICOLL fraksiyon toplayıcı İstenilen kaplara (örneğin: tüpler, flakonlar vb.)

Proteinler, tampon çözeltinin bileşiminin değiştirilmesiyle ayrıştırılır. (iyonik kuvvet, pH, iletkenlik, tuz konsantrasyonu vb.). Elüsyon koşulları doğrusal, kademeli veya parçalı kademeli olarak değiştirilebilir. A tamponundan B tamponuna akışın değiştirilmesi Mobil faz bileşiminin zaman içinde değiştiği durum.

Prosedür

Sıvı kolon kromatografisinde, kolonun eşit şekilde doldurulması önemlidir. durağan fazda hava kabarcıkları, kanallar ve çatlaklar olmadan.

LAMBDA peristaltik pompa, aşağıdaki işlemleri gerçekleştirir: sıvı mobil faz sürekli paketlenmiş kromatografi kolonuna tutarlı bir şekilde titreşimsiz tekrarlanabilir akış hızı.

Kromatografik kolonun üstüne yüklenen örnek karışım, katı sabit fazdan (reçine) geçirilerek ayrıştırılır:

Fermantasyon sıvısının bileşenleri, durağan faz üzerinde farklı derecelerde adsorbe edilir ve desorbe edilirken, Mobil fazdaki bileşenler yavaşça ayırmak birbirlerinden.

Hareketli faz kolondan akmaya devam ettikçe, kolon çıkışı veya elüat oluşur. kesirler halinde toplanmıştır kromatografik kolonun alt ucunda OMNICOLL fraksiyon toplayıcısının yardımıyla .

Kolondan veya kolondan protein ayrışmasını sürekli olarak izlemek için kullanılan bir dedektör. kesirlerin analizi hakkında bilgi verir istenen proteinin konsantrasyonu Örneğin jel elektroforezi yoluyla daha ileri işlemler için fraksiyon halinde.

 

Protein saflaştırma için elüsyon yöntemlerinin optimizasyonu

Enzim saflaştırma için sıvı kromatografisinde doğru elüsyon tamponunun seçilmesi, ayırma kalitesini ve analiz süresini önemli ölçüde iyileştirebilir.

Sıvı kolon kromatografisinde izokratik elüsyon

Sıvı kromatografisinde proteinler, aşağıdaki koşullar altında ayrıştırılır: sabit çözücü bileşimi (yani izokratik elüsyon):

  • Numuneler çok karmaşık olmadığında ve ayrıca numune bileşenlerinin tutunma süreleri benzer olmadığında.

Ayrıca, en sıkı şekilde adsorbe olan proteinler için, sabit hareketli faz bileşimi ile elüsyon daha etkili olacaktır. elüsyona çok uzun zaman alır.

İzokratik elüsyon için tampon çözelti ve peristaltik pompa kullanılır.

Gradyan elüsyonu - karmaşık karışımlardan (biyolojik örneklerden) proteinlerin saflaştırılması için kullanılır.

Gradyan elüsyonunda, bileşimi mobil faz değişiklikleri Ayırma işlemi sırasında analitlerin tutunma süresini etkiler.

Gradyan elüsyon yöntemi, protein saflaştırmada avantajlı bir şekilde kullanılır:

  • Karmaşık biyolojik örnekler
  • Mbilinen özelliklere sahip fiksürler
  • Cbenzer tutma sürelerine sahip bileşenler

Proteinlerin saflaştırılması için sıvı kolon kromatografisinde gradyan elüsyonu kullanılıyorsa, Bekleme süresi kısaltılabilir.

Gradyan elüsyonu şu şekilde gerçekleştirilir: iki tampon Ve bir veya iki peristaltik pompa.

Gradyan elüsyonu ve elüsyon profili

Gradyan elüsyonu, en kısa sürede en iyi ayrımı sağlamak için numune ayrımı sırasında hareketli faz bileşiminin değiştirileceği anlamına gelir.

Elüentin farklı bileşimi (gradyan elüsyonu) ile tutunma faktörü ve dolayısıyla kapasite faktörü etkilenebilir.

Eğim profilleri:

 

Genellikle doğrusal gradyanlar tercih edilir; bu, şu şekilde uygulanabilir: doğrusal, parçalı, dışbükey ve içbükey şekiller. Doğrusal olmayan gradyanlar, daha kısa ayırma süresi, daha iyi numune çözünürlüğü ve daha yüksek algılama hassasiyeti de dahil olmak üzere çeşitli belirgin avantajlar sunar.

Biyokimyacılar tavsiye ediyor LAMBDA peristaltik sıvı pompaları Bu, hareketli fazın titreşimsiz uygulanmasını garanti eder: www.lambda-instruments.com/peristaltic-pumps/.

Güvenilir peristaltik pompalarla gradyan üretimi

LAMBDA laboratuvar peristaltik pompaları, programlanabilir ve uzaktan kontrol edilebilir özelliktedir. doğrusal, kademeli ve segmentli gradyan elüsyonu.

Tek pompa ile kademeli elüsyon

Gradyan elüsyonu tek bir peristaltik pompa ile de gerçekleştirilebilir: kaplar elüsyon tamponu A ve B 'dır' bir sifonla bağlı veya altta akışı ayarlamak için bir vana bulunan bir boru

  1. Elüsyon tamponu A, elüsyon tamponu B ile birlikte iyice karıştırılmış beherin içine sürekli olarak çekilir; burada tampon konsantrasyonunun değiştirilmesi

  2. Programlanabilir LAMBDA peristaltik pompa şu amaçla kullanılır: Eğimli karışımı pompalamak kromatografi kolonuna

  3. Kolondan geçen elüat, pH, 280 nm absorbans ve iletkenlik ölçümü için dedektörden geçirildi.

  4. Dedektörden, elüat fraksiyonlaması toplandı OMNICOLL fraksiyon toplayıcısı tarafından istenilen kaplara aktarılır. (Örneğin: şişeler, beherler, tüpler, flakonlar vb.)

İki pompa ile gradyan elüsyonu

İki adet programlanabilir LAMBDA peristaltik pompa Gradyan elüsyonu için elüentlerin tekrarlanabilir şekilde karıştırılması amacıyla kullanılırlar.

  1. O zaman içinde bileşimdeki değişim olabilir programlanmış Veriler doğrudan LAMBDA peristaltik pompa ekranında görüntülenebilir veya PNet PC kontrol yazılımı kullanılarak gerçek zamanlı grafik olarak kaydedilip gösterilebilir.

  2. O Gradyan karışımı kromatografi kolonundan geçer. ve bileşenler birbirinden ayrılıyor.

  3. Kolondan çıkan süzüntü, ölçüm yapmak için dedektörden geçirildi. pH, 280 nm absorbsiyon ve iletkenlik.

  4. Otomatik fraksiyon toplayıcı LAMBDA OMNICOLL, elüatı fraksiyonlara ayırır ve programlanmış zamana veya düşme sayacına göre kesirleri toplar.

 

Kolon kromatografisi için pompalama sisteminin gereksinimleri

Kolon kromatografisi için pompalama sisteminin en önemli gereksinimleri şunlardır:

  • Sabit ve tekrarlanabilir akış hızı
    Tekrarlanabilirlik, piklerin tutunma sürelerine bağlıdır. Tutunma süreleri ise akış hızına bağlıdır.

  • Nabızsız akış
    Durağan faz, basınç dalgalanmalarına karşı korunmalıdır. Dedektörün taban çizgisi sabit kalmalıdır.

 

5 yıl garantili LAMBDA MULTIFLOW programlanabilir peristaltik pompalar, tekrarlanabilir akış hızları elde etmek için önerilir.

LAMBDA programlanabilir laboratuvar peristaltik pompaları

Protein saflaştırma için fraksiyonun gereksinimleri

Sıvı kolon kromatografisi için fraksiyon toplayıcısının en önemli gereksinimleri şunlardır:

  • Sınırsız kapasite
    Sınırsız sayıda fraksiyon toplama olanağı, özellikle süreç optimizasyonu sırasında son derece önemlidir.

  • Farklı hacim aralığı
    Kesir toplayıcıyı çeşitli laboratuvar deneylerine ve pilot ölçekli süreçlere uyarlayabilmek.

 

Özelleştirilebilir fraksiyon toplayıcı OMNICOLL, laboratuvar ve pilot ölçekte verimli süreç optimizasyonu için idealdir.