Čistenie proteínov: kvapalinová chromatografia a gradientová elúcia

s frakčným zberačom OMNICOLL a peristaltickými čerpadlami LAMBDA

Pre čistenie proteínov a izolácia peptidov, nukleových kyselín alebo malých molekúl zo surovej zmesi fermentačného vývaru, tekutý kolónová chromatografia (LC) sa široko používa s iónovou výmenou, hydrofóbnou interakciou, afinitou alebo vylúčením podľa veľkosti v následnom spracovaní (DSP).

Aby optimalizovať procesy kvapalinovej chromatografie, zberač frakcií OMNICOLL a spoľahlivé peristaltické kvapalinové čerpadlá LAMBDA sa úspešne používajú v laboratórnej praxi:

Príklad nastavenia automatického zberu frakcií

Napríklad kompletný usporiadanie kolónovej chromatografie s automatickým zberom eluátu pomocou zberača frakcií OMNICOLL zahŕňa:

Zberač frakcií LAMBDA OMNICOLL a peristaltické pumpy LAMBDA na čistenie proteínov koncentračným gradientom elúcie

  • Dva podobné kontajnery s elučný pufor A a B prepojený sifónom (alebo trubica v spodnej časti s ventilom na nastavenie prietoku)
  • Elučný pufor A sa konzistentne vťahuje do kadičky s elučný pufor B ktorý je neustále miešané magnetickým miešadlom, čím zmena jeho koncentrácie v pufri
  • Programovateľné peristaltické čerpadlo LAMBDA pumpujte gradientovú zmes do stĺpca
  • Eluát z kolóny prechádza cez detektor (na meranie pH, absorbancie 280 nm, vodivosti)
  • Z detektora, frakcionácia proteínov je zhromažďovaný Zberač frakcií OMNICOLL do požadovaných nádob (napr. skúmaviek, liekoviek atď.)

Bielkoviny sa eluujú zmenou zloženia pufra (iónová sila, pH, vodivosť, koncentrácia solí atď.). Elučné podmienky je možné meniť z lineárneho, postupného alebo segmentovaného postupného režimu pomocou zmena toku z pufra A do pufra B v ktorom sa zloženie mobilnej fázy v priebehu času mení.

Postup

Pri kvapalinovej kolónovej chromatografii je dôležité rovnomerné naplnenie kolóny bez vzduchových bublín, kanálikov a trhlín na stacionárnej fáze.

Peristaltické čerpadlo LAMBDA dodáva kvapalná mobilná fáza kontinuálne na kolónu s plnivej chromatografiou pri konzistentnej reprodukovateľný prietok bez pulzácií.

Zmes vzoriek nanesená na vrch chromatografickej kolóny sa separuje prechodom cez pevnú stacionárnu fázu (živicu):

Zložky fermentačného vývaru sa na stacionárnej fáze adsorbujú a desorbujú v rôznej miere, zatiaľ čo zložky v mobilnej fáze pomaly samostatné jeden od druhého.

Ako mobilná fáza ďalej prúdi kolónou, výtok z kolóny alebo eluát sa zhromaždené vo frakciách na spodnom konci chromatografickej kolóny s pomocou zberača frakcií OMNICOLL .

Detektor na nepretržité monitorovanie elúcie proteínov z kolóny alebo analýza zlomkov poskytuje informácie o koncentrácia požadovaného proteínu vo frakcii na ďalšie spracovanie, napríklad: gélovou elektroforézou.

 

Optimalizácia elučných metód na čistenie proteínov

Výber správneho elučného pufra v kvapalinovej chromatografii na čistenie enzýmov môže výrazne zlepšiť kvalitu separácie a čas analýzy.

Izokratická elucia v kvapalinovej kolónovej chromatografii

V kvapalinovej chromatografii sa proteíny separujú za konštantné zloženie rozpúšťadla (t. j. izokratická elucia):

  • Keď vzorky nie sú veľmi zložité a tiež keď zložky vzorky nemajú podobné retenčné časy.

Okrem toho, pre najpevnejšie adsorbované proteíny bude elucia s konštantným zložením mobilnej fázy trvá veľmi dlho, kým sa eluuje.

Na izokratickú eluciu sa používa pufor a peristaltické čerpadlo.

Gradientná elucia - na čistenie proteínov z komplexných zmesí (biologické vzorky)

Pri gradientovej elúcii je zloženie zmeny mobilnej fázy počas separačného procesu a ovplyvňuje retenciu analytov.

Gradientová elucia sa výhodne používa pri purifikácii proteínov:

  • Komplexné biologické vzorky
  • Mzmesi so známymi vlastnosťami
  • Czložky s podobnými retenčnými časmi

Ak sa na čistenie proteínov v kvapalinovej stĺpcovej chromatografii používa gradientová elúcia, potom čas uchovávania sa môže skrátiť.

Gradientná elucia sa vykonáva s dva nárazníky a jedno alebo dve peristaltické čerpadlá.

Gradientová elučná elučná profil

Gradientná elucia znamená, že zloženie mobilnej fázy sa bude počas separácie vzorky meniť, aby sa dosiahla optimálna separácia v minimálnom čase.

Rôzne zloženie eluentu (gradientová elúcia) môže ovplyvniť retenčný faktor, a tým aj kapacitný faktor.

Profily gradientov:

 

Lineárne gradienty sú vo všeobecnosti uprednostňované; možno ich implementovať v lineárne, segmentované, konvexné a konkávne tvary. Nelineárne gradienty ponúkajú niekoľko výrazných výhod, vrátane skráteného času separácie, zlepšeného rozlíšenia vzorky a vyššej citlivosti detekcie.

Biochemici odporúčajú Peristaltické kvapalinové čerpadlá LAMBDA ktoré zaručujú aplikáciu mobilnej fázy bez pulzácií: www.lambda-instruments.com/peristaltic-pumps/.

Generovanie gradientu so spoľahlivými peristaltickými čerpadlami

Laboratórne peristaltické čerpadlá LAMBDA sú programovateľné a diaľkovo ovládateľné na dosiahnutie lineárna, postupná a segmentovaná gradientová elúcia.

Gradientná elúcia s jedným čerpadlom

Gradientná elucia sa môže vykonávať aj pomocou jednej peristaltickej pumpy: nádoby s elučný pufor A a B sú pripojené sifónom alebo trubica v spodnej časti s ventilom na nastavenie prietoku

  1. Elučný pufor A sa postupne pridáva do dobre premiešavanej kadičky s elučným pufrom B, kde zmena koncentrácie pufra

  2. Programovateľné peristaltické čerpadlo LAMBDA používané na pumpujte gradientovú zmes do chromatografickej kolóny

  3. Eluát z kolóny prešiel detektorom na meranie pH, absorbancie pri 280 nm a vodivosti.

  4. Z detektora, zozbieraný eluát frakcionáciou pomocou zberača frakcií OMNICOLL do požadovaných nádob (napr.: fľaše, kadičky, skúmavky, ampulky atď.)

Gradientná elucia s dvoma pumpami

Dve programovateľné peristaltické čerpadlá LAMBDA sa používajú na reprodukovateľné miešanie eluentov pre gradientovú elúciu.

  1. Ten/Tá/To zmena zloženia v priebehu času môže byť naprogramovaný priamo na displeji peristaltického čerpadla LAMBDA alebo ho je možné zaznamenať a zobraziť ako graf v reálnom čase pomocou riadiaceho softvéru PNet pre PC.

  2. Ten/Tá/To gradientová zmes prechádza cez chromatografickú kolónu a komponenty sú oddelené.

  3. Eluát z kolóny prešiel detektorom na meranie pH, absorpcia pri 280 nm a vodivosť.

  4. Automatický zberač frakcií LAMBDA OMNICOLL, frakcionuje eluát a zhromažďuje frakcie na základe naprogramovaného času alebo počítadla kvapiek.

 

Požiadavky na čerpací systém pre kolónovú chromatografiu

Najdôležitejšie požiadavky na čerpací systém pre kolónovú chromatografiu sú:

  • Konštantný a reprodukovateľný prietok
    Reprodukovateľnosť závisí od retenčných časov píkov. Retenčné časy závisia od prietoku.

  • Prietok bez pulzácií
    Stacionárna fáza musí byť chránená pred tlakovými rázmi. Základná línia detektora by mala zostať stabilná.

 

Na dosiahnutie reprodukovateľných prietokov sa odporúčajú programovateľné peristaltické čerpadlá LAMBDA MULTIFLOW, na ktoré sa vzťahuje 5-ročná záruka.

Programovateľné laboratórne peristaltické čerpadlá LAMBDA

Požiadavky na frakciu na čistenie proteínov

Najdôležitejšie požiadavky na zberač frakcií pre kvapalinovú kolónovú chromatografiu sú:

  • Neobmedzená kapacita
    Možnosť zhromažďovať neobmedzený počet frakcií je mimoriadne dôležitá, najmä pri optimalizácii procesov.

  • Rôzny rozsah hlasitosti
    Byť schopný prispôsobiť zberač frakcií pre rôzne laboratórne experimenty a pilotné procesy.

 

Prispôsobiteľný zberač frakcií OMNICOLL je ideálny pre efektívnu optimalizáciu procesov v laboratórnom aj pilotnom meradle.