Čištění proteinů: Kapalinová chromatografie a gradientová eluce

s frakčním sběračem OMNICOLL a peristaltickými čerpadly LAMBDA

Pro čištění proteinů a izolace peptidů, nukleových kyselin nebo malých molekul ze surové směsi fermentačního vývaru, kapalný sloupcová chromatografie (LC) je široce používána s iontovou výměnou, hydrofobní interakcí, afinitou nebo vylučováním podle velikosti v následném zpracování (DSP).

Abychom optimalizovat procesy kapalinové chromatografie, sběrač frakcí OMNICOLL a spolehlivá peristaltická kapalinová čerpadla LAMBDA se úspěšně používají v laboratorní praxi:

Příklad nastavení automatického sběru frakcí

Například kompletní uspořádání sloupcové chromatografie s automatickým sběrem eluátu pomocí sběrače frakcí OMNICOLL zahrnuje:

Frakční sběrač LAMBDA OMNICOLL a peristaltické pumpy LAMBDA pro purifikaci proteinů koncentračním gradientem eluce

  • Dvě podobné nádoby s eluční pufr A a B propojené sifonem (nebo trubice ve spodní části s ventilem pro nastavení průtoku)
  • Eluční pufr A je soustavně vtahován do kádinky s eluční pufr B který je neustále míchané magnetickým míchadlem, čímž změnou koncentrace pufru
  • Programovatelné peristaltické čerpadlo LAMBDA pumpujte gradientní směs do sloupce
  • Eluát z kolony prochází skrz detektor (pro měření pH, absorbance 280 nm, vodivosti)
  • Z detektoru, frakcionace proteinů je shromažďován Sběrač frakcí OMNICOLL do požadovaných nádob (např. zkumavek, lahviček atd.)

Proteiny se eluují změnou složení pufru (iontová síla, pH, vodivost, koncentrace solí atd.). Eluční podmínky lze změnit z lineárního, krokového nebo segmentovaného krokového režimu pomocí změna toku pufru A do B ve kterém se složení mobilní fáze v průběhu času mění.

Postup

V kapalinové sloupcové chromatografii je důležité rovnoměrné naplnění kolony bez vzduchových bublin, kanálků a trhlin na stacionární fázi.

Peristaltické čerpadlo LAMBDA dodává kapalná mobilní fáze kontinuálně na plněnou chromatografickou kolonu při konzistentní reprodukovatelný průtok bez pulzací.

Směs vzorků nanesená na chromatografickou kolonu se separuje průchodem pevnou stacionární fází (pryskyřicí):

Složky fermentačního vývaru jsou na stacionární fázi adsorbovány a desorbovány v různé míře, zatímco složky v mobilní fázi pomalu samostatný jeden od druhého.

Jak mobilní fáze dále proudí kolonou, eluát neboli eluát z kolony se shromážděno ve frakcích na spodním konci chromatografické kolony s pomocí sběrače frakcí OMNICOLL .

Detektor pro kontinuální sledování eluce proteinu z kolony nebo analýza zlomků poskytuje informace o koncentrace požadovaného proteinu ve frakci pro další zpracování, například: gelovou elektroforézou.

 

Optimalizace elučních metod pro purifikaci proteinů

Výběr správného elučního pufru v kapalinové chromatografii pro purifikaci enzymů může výrazně zlepšit kvalitu separace a dobu analýzy.

Izokratická eluce v kapalinové sloupcové chromatografii

V kapalinové chromatografii se proteiny separují za konstantní složení rozpouštědla (tj. izokratická eluce):

  • Pokud vzorky nejsou příliš složité a také pokud složky vzorku nemají podobné retenční časy.

Kromě toho u nejpevněji adsorbovaných proteinů bude eluce s konstantním složením mobilní fáze... trvá velmi dlouho, než se eluuje.

Pro izokratickou eluci se používá pufr a peristaltické čerpadlo.

Gradientní eluce - pro purifikaci proteinů ze složitých směsí (biologických vzorků)

Při gradientové eluci je složení změny mobilní fáze během separačního procesu a ovlivňuje retenci analytů.

Gradientní eluce se s výhodou používá při purifikaci proteinů:

  • Komplexní biologické vzorky
  • Msměsi se známými vlastnostmi
  • Csložky s podobnými retenčními časy

Pokud se v kapalinové sloupcové chromatografii pro purifikaci proteinů používá gradientová eluce, pak doba uchování se může zkrátit.

Gradientní eluce se provádí s dva nárazníky a jedno nebo dvě peristaltická čerpadla.

Gradientní eluce a eluční profil

Gradientní eluce znamená, že složení mobilní fáze se bude během separace vzorku měnit pro optimální separaci v minimálním čase.

Různým složením eluentu (gradientní eluce) by mohl být ovlivněn retenční faktor, a tím i kapacitní faktor.

Profily gradientů:

 

Lineární gradienty jsou obecně preferovány; lze je implementovat v lineární, segmentované, konvexní a konkávní tvary. Nelineární gradienty nabízejí několik zřetelných výhod, včetně zkrácené doby separace, lepšího rozlišení vzorku a vyšší citlivosti detekce.

Biochemici doporučují Peristaltická kapalinová čerpadla LAMBDA které zaručují aplikaci mobilní fáze bez pulzací: www.lambda-instruments.com/peristaltic-pumps/.

Generování gradientu se spolehlivými peristaltickými čerpadly

Laboratorní peristaltická čerpadla LAMBDA jsou programovatelná a dálkově ovladatelná pro dosažení lineární, postupná a segmentovaná gradientová eluce.

Gradientní eluce s jedním čerpadlem

Gradientní eluci lze provést také pomocí jednoho peristaltického čerpadla: nádoby s eluční pufr A a B jsou připojené sifonem nebo trubice ve spodní části s ventilem pro nastavení průtoku

  1. Eluční pufr A se postupně přidává do dobře míchané kádinky s elučním pufrem B, kde změna koncentrace pufru

  2. Programovatelné peristaltické čerpadlo LAMBDA používané k pumpujte gradientní směs do chromatografické kolony

  3. Eluát z kolony prošel detektorem pro měření pH, absorbance při 280 nm a vodivosti.

  4. Z detektoru, eluát získaný frakcionací pomocí sběrače frakcí OMNICOLL do požadovaných nádob (např.: lahve, kádinky, zkumavky, lahvičky atd.)

Gradientní eluce se dvěma pumpami

Dvě programovatelná peristaltická čerpadla LAMBDA se používají pro reprodukovatelné míchání eluentů pro gradientovou eluci.

  1. Ten/Ta/To změna složení v průběhu času může být naprogramovaný přímo na displeji peristaltického čerpadla LAMBDA nebo jej lze zaznamenat a zobrazit jako graf v reálném čase pomocí řídicího softwaru PNet pro PC.

  2. Ten/Ta/To gradientová směs prochází chromatografickou kolonou a komponenty jsou odděleny.

  3. Eluát z kolony prošel detektorem pro měření pH, absorpce 280 nm a vodivost.

  4. Automatický sběrač frakcí LAMBDA OMNICOLL, frakcionuje eluát a shromažďuje frakce na základě naprogramovaného času nebo počítadla kapek.

 

Požadavky na čerpací systém pro sloupcovou chromatografii

Nejdůležitější požadavky na čerpací systém pro sloupcovou chromatografii jsou:

  • Konstantní a reprodukovatelný průtok
    Reprodukovatelnost závisí na retenčních časech píků. Retenční časy závisí na průtoku.

  • Průtok bez pulzací
    Stacionární fáze musí být chráněna před tlakovými rázy. Základní linie detektoru by měla zůstat stabilní.

 

Pro dosažení reprodukovatelných průtoků se doporučují programovatelná peristaltická čerpadla LAMBDA MULTIFLOW s 5letou zárukou.

Programovatelná laboratorní peristaltická čerpadla LAMBDA

Požadavky na frakci pro purifikaci proteinů

Nejdůležitější požadavky na sběrač frakcí pro kapalinovou sloupcovou chromatografii jsou:

  • Neomezená kapacita
    Možnost shromažďovat neomezený počet frakcí je nesmírně důležitá, zejména při optimalizaci procesů.

  • Různý rozsah hlasitosti
    Umět přizpůsobit sběrač frakcí pro různé laboratorní experimenty a pilotní procesy.

 

Přizpůsobitelný sběrač frakcí OMNICOLL je ideální pro efektivní optimalizaci procesů v laboratorním i pilotním měřítku.