Purification des protéines : chromatographie liquide et élution par gradient

avec le collecteur de fractions OMNICOLL et des pompes péristaltiques LAMBDA

Pour la purification des protéines et l'isolement de peptides, d'acides nucléiques ou de petites molécules à partir du mélange brut de bouillon de fermentation, la chromatographie liquide sur colonne (LC) est largement utilisée basée sur des phénomènes d'échange d'ions, d'interaction hydrophobe, d'affinité ou d'exclusion de taille (DSP).

Pour optimiser les procédés de chromatographie liquide, le collecteur de fractions OMNICOLL et les pompes à liquides péristaltiques fiables LAMBDA sont utilisés avec succès dans la pratique du laboratoire :

Exemple de configuration d'une collecte automatique de fractions

Par exemple, un dispositif de chromatographie sur colonne avec collecte automatique de l'éluat obtenu à l'aide du collecteur de fractions OMNICOLL comprend :

Collecteur de fractions LAMBDA OMNICOLL et pompes péristaltiques LAMBDA pour la purification des protéines par élution en gradient de concentration

  • Deux récipients similaires avec les tampons d'élution A et B reliés par un siphon (ou un tuyau avec une vanne permettant de régler le débit)
  • Tampon d'élution A constamment aspiré dans le bécher adjacent et tampon d'élution B qui est constamment mélangé par agitateur magnétique, par conséquent ce qui va en modifier sa concentration
  • Pompe péristaltique programmable LAMBDA à pour pomper le mélange à gradient dans la colonne
  • L'éluat passe par le détecteur (pour mesurer le pH, l'absorbance à 280 nm ou la conductivité)
  • En sortie du détecteur, la liquide contenant les protéines est collecté par le collecteur de fractions OMNICOLL dans les récipients souhaités (ex : tubes, flacons, etc.)

Les protéines sont éluées en modifiant la composition du tampon (force ionique, pH, conductivité, concentration en sels, etc.). Les conditions d'élution peuvent être variables: linéaires, par paliers ou par paliers segmentés. Il suffit pour cela de modifier le flux du tampon A vers le tampon B, dans lequel la composition de la phase mobile change au fil du temps.

Procédure

En chromatographie liquide sur colonne, il est important de remplir la colonne uniformément. sans bulles d'air, canaux ni fissures dans la phase stationnaire.

La pompe péristaltique LAMBDA alimente la phase mobile liquide en continu à la colonne de chromatographie garnie a un débit constant reproductible sans pulsation.

Le mélange d'échantillons déposé en haut de la colonne chromatographique est séparé par passage à travers la phase stationnaire solide (résine) :

Les constituants du bouillon de fermentation sont adsorbés et désorbés à des degrés divers sur la phase stationnaire, tandis que les composants de la phase mobile sont séparés lentement les uns des autres.

Lorsque la phase mobile continue de circuler à travers la colonne, l'effluent ou l'éluat de la colonne est collecté en fractions à l'extrémité inférieure de la colonne chromatographique avec l'aide du collecteur de fractions OMNICOLL .

Un détecteur pour surveiller en continu l'élution des protéines de la colonne ou l'analyse des fractions donne des informations sur la concentration de la protéine souhaitée dans la fraction pour un traitement ultérieur, par exemple : par électrophorèse sur gel.

 

Optimisation des méthodes d'élution pour la purification des protéines

Le choix du bon tampon d'élution, en chromatographie liquide pour la purification d'enzymes, peut considérablement améliorer la qualité de la séparation et le temps d'analyse.

Elution isocratique en chromatographie liquide sur colonne

En chromatographie liquide, les protéines sont séparées en maintenant la composition de solvant constante (c.-à-d. élution isocratique) :

  • Lorsque les échantillons ne sont pas très complexes et également lorsque les composants de l'échantillon n'ont pas des temps de rétention similaires.

De plus, pour les protéines les plus fortement adsorbées, l'élution avec une composition de phase mobile constante pourra prendre beaucoup de temps.

Un tampon et une pompe péristaltique sont utilisés pour l'élution isocratique.

Élution par gradient - pour la purification des protéines à partir de mélanges complexes (échantillons biologiques)

En élution par gradient, la composition de la phase mobile change durant le processus de séparation et influence la rétention des analytes.

L'élution par gradient est avantageusement utilisée dans la purification des protéines :

  • Échantillons biologiques complexes
  • Mélangesaux propriétés connues
  • Composantsavec des temps de rétention similaires

Si l'élution par gradient est utilisée en chromatographie liquide sur colonne pour la purification des protéines, alors le temps de rétention peut être raccourci.

L'élution par gradient est réalisée avec deux tampons et une ou deux pompes péristaltiques.

Élution par gradient et profil d'élution

L'élution par gradient implique que la composition de la phase mobile est modifiée pendant la séparation des échantillons pour une séparation optimale en un minimum de temps.

La composition différente de l'éluant (élution par gradient) permet d'influencer le facteur de rétention et donc le facteur de capacité.

Les profils de gradient :

 

Les gradients linéaires sont généralement préférés ; ils peuvent être implémentés sous formes linéaires, segmentées, convexes et concaves. Les gradients non linéaires offrent plusieurs avantages distincts, notamment un temps de séparation réduit, une résolution d'échantillon améliorée et une sensibilité de détection plus élevée.

Les biochimistes recommandent les pompes péristaltiques pour liquides LAMBDA car elles garantissent un flux sans pulsation de la phase mobile : www.lambda-instruments.com/peristaltic-pumps/.

Génération de gradients avec des pompes péristaltiques fiables

Les pompes péristaltiques de laboratoire LAMBDA sont programmables et peuvent être commandées à distance pour réaliser des profiles d' élution par gradient linéaire, par paliers et segmenté.

Élution par gradient avec une seule pompe

L'élution par gradient peut également être réalisée avec une seule pompe péristaltique : les conteneurs avec tampon d'élution A et B sont reliés par un siphon ou un tuyau muni d'une vanne pour régler le débit.

  1. Le tampon d'élution A est introduit de manière constante dans le bécher contenant le tampon d'élution B, préalablement agité, ce qui en modifie la concentration.

  2. Une pompe péristaltique programmable LAMBDA utilisée pour pomper le mélange pour le gradient dans la colonne de chromatographie

  3. L'éluat de la colonne passe à travers le détecteur pour mesurer le pH, l'absorbance à 280 nm et la conductivité.

  4. En sortie du détecteur, la collecte de l'éluat par le collecteur de fractions OMNICOLL dans les récipients souhaités (ex : bouteilles, béchers, tubes, flacons, etc.)

Élution par gradient avec deux pompes

Deux pompes péristaltiques programmables de LAMBDA sont utilisées pour un mélange reproductible des éluants pour produire un gradient de concentration.

  1. Le changement de la composition au fil du temps peut être programmée directement sur l'écran de la pompe péristaltique LAMBDA ou elle peut être enregistrée et affichée sous forme de graphique en temps réel à l'aide du logiciel de contrôle PC PNet.

  2. Le mélange en gradient traverse la colonne de chromatographie et les différents composants sont séparés.

  3. L'éluat de la colonne traverse le détecteur pour mesurer le pH, l'absorption à 280 nm ou la conductivité.

  4. Le collecteur de fractions automatisé LAMBDA OMNICOLL collecte l'éluat en fonction du temps programmé ou du compte-gouttes.

 

Exigences du système de pompage pour la chromatographie sur colonne

Les exigences les plus importantes du système de pompage pour la chromatographie sur colonne sont :

  • Débit constant et reproductible
    La reproductibilité dépend des temps de rétention des pics. Ces temps de rétention dépendent du débit.

  • Écoulement sans pulsation
    La phase stationnaire doit être protégée contre les surpressions. La ligne de base du détecteur doit rester stable.

 

Les pompes péristaltiques programmables LAMBDA MULTIFLOW, assorties d'une garantie de 5 ans, sont recommandées pour obtenir des débits reproductibles.

Pompes péristaltiques de laboratoire programmables LAMBDA

Exigences de la fraction pour la purification des protéines

Les exigences les plus importantes concernant le collecteur de fractions pour la chromatographie sur colonne liquide sont les suivantes :

  • Capacité illimitée
    La possibilité de collecter un nombre illimité de fractions est extrêmement importante, notamment lors de l'optimisation des processus.

  • Gamme de volumes différents
    Afin de pouvoir adapter le collecteur de fractions à diverses expériences de laboratoire et à des procédés à l'échelle pilote.

 

Le collecteur de fractions personnalisable OMNICOLL est idéal pour une optimisation efficace des processus à l'échelle du laboratoire et du pilote.